Antibiograma y Epsilon test

Objetivo:

Observar la resistencia de un microorganismos a un determinado antibiótico.

Fundamento teórico:

El antibiograma es el procedimiento microbiólogico que permite determinar la sensibilidad o resistencia de una cepa bacteriana frente a un grupo de antibióticos.

La sensibilidad de una bacteria a un antibiótico se evalúa determinando la concentración minima inhibidora (CMI) cantidad de antibiótico minima capaz de impedir el crecimiento de una bacteria determinada.

El antibiótico puede ser:

-Sensible- el antibiótico es una buena opción terapeútica.

-Resistente- este antibiótico no será efectivo como tratamiento.

-Intermedia-tiene cierto efecto pero no es suficiente.


Materiales:

-Microorganismo: S.aureus.

-Asa de siembra.

-Mueller-Hinton

-Antibióticos.

-Suero Salino

-Hisopo


Procedimiento:

-De un cultivo puro y joven cogemos tres o cuatros colonias y las introducimos con un asa en un suero salino ( debemos conseguir  en la escala de  MacFarland) .

-Sumergir con un hisopo en la solución bacteriana inocular toda la  placa de Mueller-Hinton.

-Cololcar con una pinzas los dicos impregnados con antibiótioticos .

-Los antibióticos  utilizados:

-Vancomycin

-Cefotaxima.

-Amoxicilina

- Clorafenil

-Gentamicina

-Cloranifecol.

-Incubar a 37ºC a durante 24 horas.

-Medir el halo formado.


Datos:

CTX -Resistente <14mm
          -Intermedio  (15-22) mm
          -Sensible  >23mm

GM  -R <12 mm
        -I (13-14) mm
         -S >14


C   -R <12
      -I (13-17)mm
      -S >18

AMC-R <13
         -I ( 14-17)mm
         -S >18


Resultados:

 Vancomycin--- halo formado 1.7cm -17mm (Intermedio)

Cefataxima --2.2cm -22mm( Intermedio)

Amoxicilina--2.3cm ( Sensible)

Cloranifecol--3cm (Sensible)

Gentamicina--1.6cm (Sensible)






Tira Etest

Se trata de un gradiente estable predefinido de 15 concentraciones  de antibióticos sobre una tira de plástico que lleva impresa la escala de valores de CMI.



Este procedimiento es similar al antibiograma, ya que se coloca la tira en el agar Mueller-Hinton  y se incuba. Se formará una elipse de inhibición. 
 


 
Utilizemos  E-coli

Tira API

Objetivo:

Realizar una identificación rapida de enterobacterias y de Gram (-).

Fundamento teórico:

La tira api tiene en este caso 20 pocillos con distintos sustratos deshidratados. Cada tubo es una prueba distinta. Hay pruebas que se hacen de forma independiente como la oxidasa,

Los pocillos se inoculan con una suspensión de microorganismos, en agua o solución salina, que rehidrata los medios.

Las galerias se incuban a 37ºC durante 24 horas, pasado este tiempo en algunos pocillos se habrá producido un cambio de color  en otros habrá que añadir reactivos.

La lectura se hace por comparación con una tabla de lecturas donde se indican si los microorganismos deben considerarse positivos o negativos.


Materiales:

-Tira Api.

-Solución salina.

-Pipeta pasteur

-Estufa

-Mechero.

-Asa.

Procedimiento:

-Realizamos una suspensión de un cultivo joven y puro de Proteus  con 5ml de solución salina.

-Una vez preprada la suspensión llenamos los tubos.

-En los pocillos  CIT, VP y GEL hay una cúpula que debemos llenar añadiendo más suspensión bacteriana.

-En los pocillos ADH, LDC, ODC, URE y H2S hay una cúpula a la cual le debemos añadir vaselina liquida para crear las condiciones anaerobias.

-Poner en la tira humedad para la incubación.

-Incubar a 37ºC durante 24 horas.


Resultados:

-Si la glucosa da negativo y los tests positivos son dos o menos de dos, no hay que añadir reactivos. 

-Si la glucosa es positiva y/o tres o más tests son positivos se revelan los test que requieren reactivos.

TDA--- AÑADIR UNA GOTA DE FeCl3

VP------ añadir una gota de reactivo 1 (KOH 40%) y una gota de reactivo 2(C2H5OH).

IND---- UNA GOTA DE REACTIVO DE KOVACS

Hacer la prueba oxidasa y nitratos ( rojo directamente por lo que tiene NO2--)  independientemente.




Proteus

Lactosa ---negativo

Ureasa -- positivo

SH2-----Positivo

Pruebas bioquímicas bacilos gram negativo.

IMVIC

El imvic está formado por cuatro pruebas bioquimicas ( rojo de metilo, voges-proskauer, indol y citratos) se utiliza fundamentalmente  para la identificación de las enterobacterias. En estas pruebas utilizemos E-coli.


INDOL


La triptofanasa es una enzima que degrada el triptófano; en esta degradación se libera indol. Para poder localizarlo añadimos el reactivo de kovac.
 
Materiales: 

-Un tubo de caldo de peptona.

-Reactivo Kovacs.

-Estufa.

-Mechero.

-Asa.
 
 Procedimiento:

-Inocular una o dos colonias en caldo de peptona.

-Incubar durante (24-48)h  a 37ºC.

-Añadir 4 gotas de reactivo de kovac.


Resultados:

-Aparece una banda de color rojo o rosa intenso: positivo.

-Medio amarillo: Negativo.

E.coli ----> Positivo

 ROJO DE METILO.


Se utliza para detectar la fermentación ácida-mixta. Se acumulan acidos y baja el pH, cuyo cambio es  detectado por un indicador   



Materiales:

-Tubo de Clark-Lubs

- Rojo de metilo.

-Tubo de ensayo pequeño

-Asa.

 Procedimiento:

-Coger una o dos colonias e inocular el tubo.

-Incubar durante (24-48)h a 37ºC. 
  
-Añadir 5 gotas de rojo de metilo. 

Resultados:

Rojo---- Positivo

Amarillo-----Negativo

E-coli---Positivo

VOGES PROSKAUER


Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de una bacteria de fermentar glucosa por vía butanodiólica. Para detectar esta fermentación se utiliza alfa-naftol que reacciona con la acetoina, para formar un compuesto rojizo.


Materiales:

-Alfa-naftol

-KOH

-MRVP

-Asa

-Microorganismo.

-Mechero.

-Estufa.


 
Procedimiento:

 
-Suspender el inóculo en medio de cultivo MVRP por rotación.

-Incubar a 37ºC durante (24-48)h.

-Añadir unas gotas de alfa-naftol y 4 gotas de KOH


Resultados:

Medio de color amarillo --> negativo

Medio de color rosado ---> positivo


E-coli ---> negativo

 CITRATO

 La prueba del citrato se realiza para saber  si la bacteria es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono  y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo.


Materiales:

-Medio citrato de Simons.

-Asa

-Mechero.

- Estufa


Procedimiento: 

Realizar una siembra por agotamiento en la superficie del agar inclinado.
-Incubar 24h a 37ºC.



Resultado:  


Color azul ----> citarto-positivo.

No cambia de color---> citrato-negativo.

E.coli----> Negativo

En la imagen comparamos uno positivo y otro negativo.











KLIGLER

Esta prueba se utiliza para la diferenciación de enterobacterias y que permite determinar:

-Si el microorganismo metaboliza glucosa y lactosa.

-Producción de gas.

-Producción de ácido sulfhídrico.

Materiales:

-Hilo.

-Agar hierro kligler

-Estufa.

-Mechero.

Procedimiento:

-Sembrar el medio de cultivo, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio.

-Incubar a 37ºC durante 24h.


Resultados: 

Pico rojo/ fondo amarillo: la bacteria solamente fermenta la lactosa.

Pico amarillo/ fondo amarillo: la bacteria fermenta glucosa y lactosa.

Pico rojo/ fondo rojo: la bacteria no fermenta azúcares.

Presencia de burbujas o ruptura del medio: la bacteria produce gas.

Ennegrecido : la bacteria produce ácido sulfhídrico.


E-coli: Glucosa-amarillo
            Lactosa-amarillo
             SH2-no ennegrecido
             No produce gas

 



Fenilalanina desaminasa.


La fenilalanina desaminasa es una enzima que desamina la fenilalanina, produciendo ácido fenilpirúvico.

Se le añade cloruro ferrico al 10%, actúa como agente quelante del ácido  fenilpirúvico, formando un complejo de color verde.

Materiales:

-Medio de  fenilalanina agar.

-Hilo de siembra.

-Estufa.

-Mechero 

-FeCl3

Procedimiento:

-Sembra por punción el medio.

-Incubar durante 24 h a 37ºC en anaerobiosis.

-Añadir unas gotas de una solución acuosa de FeCl3 

Resultados:

Color verde ---- Desaminasa-positivo.

Sin cambio de color---- Desaminasa negativo.

E-coli ---negativo

UREA

La ureasa es una enzima que degrada la urea.  En esta degradación se libera amoniaco, que alcaliniza el medio. Para detectar la reacción se usa un indicador de pH que vira a rosa intenso cuando el pH aumenta.

Materiales:

-Agar urea de Christensen en tubo inclinado.

-Asa.

-Mechero.

-Estufa.

Procedimiento:

-Inocular una o dos colonias en el medio de agar.

-Incubar a 37ºC durante 48 horas.

Resultados:

Color rosado-- positivo.

Sin cambio de color---negativo

Proteus----positivo 

 

Pruebas bioquimicas cocos Gram (-).

Oxidasa:

 En la prueba de la oxidasa actúa una enzima denominada citocromooxidasa, esta enzima  se encarga de oxidar la fenilendiamina y forma el indofenol, que es un compuesto de color violeta.

Materiales:

-Papel de filtro.

-Fenilendiamina.

-Asa.

-Un medio de cultivo joven ( E-coli)

-Mechero.

 Procedimiento: 

-Depositar sobre el papel de filtro una colonia joven y fenilendiamina.

-Esperar unos ( 10-30) segundos.


Resultados: 

Aparición de un color azul-violeta ---> oxidasa positivo.

Aparición de un color rosado  o no hay ningún cambio de color ---> oxidasa negeativo.


Como podemos observar en la imagen, nuestra bacteria es oxidasa (+).

ONPG

 La prueba de ONPG permite saber si la bacteria es capaz de fermentar la lactosa. Se observa si la bacteria  sintetiza la enzima beta-galactosidasa que hidroliza la lactosa  para formar galactosa y glulcosa. 

La prueba se basa en poner en contacto la colonia con el compuesto ONPG (ortonitrofenil-beta-D-galactopiranósido) que es muy parecido estructuralmente a la lactosa.


Materiales:

-Microorganismo: Proteus.

-Disco de ONPG.

-Suspensión de una o dos colonias.

-Estufa.

-Alcohol.

-Pinzas de metal

-Mechero.


Procedimiento:

-Preparamos una suspensión de suero fisiologico esteril  con una o dos colonias.

-Introducimos un disco de ONPG con las pinzas ( previamente mojadas con alcohol y las pasamos por el mechero).

-Incubar durante 4 horas a 37ºC.

Resultado:

Medio de color amarillo ---> beta-galactosidasa positiva. 
Medio incoloro o amarillo muy pálido ------> betagalactosidasa negativa ( se incuba otras 24 horas y se repite la lectura).

En nuestro caso, con colonias de Proteus nos salió negativo.

 



Fermentación de azúcares:

Las bacterias anaerobias y anaerobias facultativas fermentan los carbohidratos produciendo ácido  y gas los cuales son detectados  mediante un indicador de pH y la campana de Durham.

Material:

-Campana de Durham.

-Asa de siembra.

-Tubo liquido con caldo de peptona con indicador de pH.

-Microorganismo: E-coli

-Carbohidrato: 


Procedimiento:

-En el medio de cultivo  con la campana de Durham , introducimos varias colonias del microorganismo y lo incubamos a 37ºC durante 24 horas.


Resultado:

Como podemos observar nuestros tubos se quedaron naranjas tenian que haber cambiado a amarillo por que E.coli fermenta la glucosa.

 





  

Pruebas bioquimicas cocos gram (+).

Objetivo:

Realizar las siguientes pruebas bioquímicas  para identificar las características metabólicas de la bacteria ( en nuestro caso S.aureus). Para llevar a cabo este tipo de pruebas es necesario realizar previamente el aislamiento y cultivo de la bacteria para obtener un cultivo puro y fresco.


Fundamento teórico:

-Catalasa:

La catalasa hidroliza el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno gaseoso, que se libera formando burbujas.

Materiales:

-Portaobjetos.
-Asa.
-Cultivo joven
-Peróxido de hidrógeno.

Procedimiento:

-En un porta depositamos una colonia y  añadimos una gota de peróxido de hidrógeno.


Resultados:

Si se produce burbujas --->catalasa positiva.

Si no se produce burbujas ---> catalasa negativo.

En nuestro caso nos salió como el caso B

-Oxidación - Fermentación.

Mediante esta prueba se  valora si la bacteria tiene un metabolismo oxidativo o fermentativo.
En la vía de la fermentación se produce un cambio en el pH, para que dicho cambio sea visible el medio incorpora un indicador de pH. El indicador vira de verde a amarillo si aumenta la acidez.

Materiales:

- Dos tubos con medio Hugh-Leifson.

-Vaselina.

-Estufa.

-Hilo de siembra.

-Mechero.
 

Procedimiento:

-Sembramos por picadura ( previamente esterilizada)   dos tubos de Hugh-Leifson, uno lo  cubrimos con vaselina y al otro no.

-Incubar durante (24-48)h a 37ºC.


Resultados:

Tubo sin vaselina amarillo y tubo cubierto verde ----> Aerobia estricta.

-Ambos tubos amarillos---> Aerobia  facultativa.

-Tubo sin cubrir verde y tubo cubierto amarillo ----> Anaerobia estricta.


  En nuestro caso nos salió los dos verdes pero era porque utilizemos un cultivo que era joven ya que al hacerle una prueba catalasa salió negativa cuando el S. aureus es positivo.

El S.aureus es anaerobio facultativo.







Coagulasa:


La coagulasa es una enzima capaz de desnaturalizar la fibrina del plasma.  La coagulasa nos permite identificar en el laboratorio los diferentes tipos de staphilococcus, siendo en el S.aureus positiva.

Materiales: 

-Tubo con plasma.

-Asa.

-Cultivo fresco.

-Estufa.

Procedimiento:

-Se añade una suspensión densa de bacterias  a un tubo pequeño con plasma y se incuba a 37ºC. Se observa entre (6-24)h.


Resultados:

Si sale positivo se observara  la coagulación del suero.

Si sale negativa el plasma  seguira siendo líquido.



 En nuestro caso nos salió (+).

 


D-nasa

La Dnasa es una enzima que cataliza la rotura de los enlaces fosfodiester en el  ADN. Esta prueba se utiliza principalmente para la identificación de staphylococcus, ya que las bacterias de este género producen grandes cantidades de ADNasa extracelular.

Materiales:  

-Placa de medio agar ADNasa.

-Estufa

-Acido clorhidrico 1N.

-Azul de toluidina 

-Microorganismo: S. aureus y S.epidermidis

 


Procedimiento:

-Inocular una placa de medio agar Dnasa con los dos microorganismos.


-Incubar en la estufa a 37ºC durante (24-48)h.

-Inundar la placa con ácido clorhidrico 1N y azul de toluidino, esperar dos minutos y efectuar la lectura.


Resultados:
 
-Si se observa un halo transparente alrededor de la zona inoculada es ADNasa positivo.

-Si se observa que el medio está opaco ADNasa negativo.

En nuestro caso observamos un halo transparente, por lo que podemos concluir que S.aures  es ADNasa positivo y el S.epidermidis es negativo.

Bilis esculina

Con este medio utilizemos streptococcos.

Este medio se utiliza para la identificación presuntiva de streptococos del grupo D.  El  agar contiene esculina, que en presencia de iones hierro forma un compuesto cuyo color va de verde olivo hasta negro. Las sales biliares que contiene inhibe el desarollo de la flora acompañante.


Materiales: 

-Tubo bilis esculina.

-Asa.

-Estufa. 

 -Mechero.

Procedimiento: 

-Inocular el tubo, con una asa ( previamente esterilizada) con un cultivo joven.

-Incubar durante tres días a 37ºC en anaerobiosis.
 

Resultados:

Ennegricimiento del medio :positivo.
 
 Ausencia de oscurecimiento: Negativo.

Nosotras al utilizar streptococos la prueba nos salió positivo.

Sensibilidad a la optoquina:

La  optoquina a muy baja concentración inhibe  el crecimiento de Steptococcus pneumoniae, mientras que no afecta al crecimiento de los Streptococcus alfa-hemoliticos. Por tanto, esta prueba permite saber si una colonia de Streptococcus es del género S.pneumaniae 


Materiales:  

-Placa de agar sangre de carnero 5%.

-Disco de optoquina.

-Estufa.

Procedimiento: 

En la placa de agar de sangre de carnero (5%) , sembramos S.Pyogenes por toda la placa con la ayuda de un asa ( previamente esterilizada) y en el  centro con la ayuda de unas pinzas ( previamente esterilizadas)  ponemos un disco con optoquina.


Resultados:

Negativo: La bacteria es resistentea la sustancia.
Positivo:  La bacteria es sensible a la sustancia.

Nuestro S. aureus es resistente

Tinción de Ziehl-Neelsen

Objetivo:

Observar bacterias resistentes a la coloración por una mezcla de ácido-alcohol.

Fundamento teórico:

La tinción de Ziehl-Neelsen es una tinción diferencial que permite distinguir un grupo especial de bacterias cuya pared presenta resistencia a la decoloración por una mezcla de ácido-alcohol (BAAR).

Tiene gran importancia, porque entre las BAAR se encuentran las micobacterias, agentes etiológicos de enfermedades comola tuberculosis y la lepra.
 
Materiales:

-Microscopio.
-Fucsina fenicada.
-Mechero de alcohol.

-Agua destilada.
-Azul de metileno.
-Portaobjetos.
-Algoodón.
-Hilo.
-Alcohol.

Procedimiento:

-Se parte de una extensión fijada por calor.

-Cubrir el portaobjetos con fucsina, calentarlo como en la práctica anterior ( tinción de esporas) durante 15 minutos.

-Lavar con agua destilada.

-Cubrir con azul de metileno e incubar durante 1-3 minutos a temperatura ambiente.

-Lavar con agua destilada.

-Observar al microscopio.

Resultados:

En la imagen podemos observar  que las bacterias que resisten a la decoloración son rojas y las que no se ven de color azul.

Tinción de esporas.

Objetivo:

Observar las esporas bacterianas.

Fundamento teórico:

 Las endosporas bacterianas se sitúan en el interior del cuerpo celular y por su estructura, con varias cubiertas es impermeables . Requieren tinciones con calor para favorecer la penetración de los colorantes.
La técnicas más empleada es la tinción de Wirtz-Conklin.

Materiales:

-Mechero de alcohol
-Verde de malaquita al 5%.
-Agua destilada.
-Safranina.
-Microscopio.
-Algodón.
-Hilo.
-Alcohol.





Procedimiento:

-Partimos de una extensión fijada.

-Ponemos un papel de filtro encima del portaobjetos y lo cubrimos con verde de malaquita al 5% calentar el portaobjetos por debajo ( lo calentamos con un hilo al que ponemos una bola de algodón al que añadimos alcohol).

-Durante 5 minutos.

-Lavar con abundante agua.

-Cubrir con safranina al 0.5%.

-Lavar con abundante agua y dejar secar la preparación.

-Visualizar la preparación  al microscopio.


Resultados: