Tinción de Ziehl-Neelsen

Objetivo:

Observar bacterias resistentes a la coloración por una mezcla de ácido-alcohol.

Fundamento teórico:

La tinción de Ziehl-Neelsen es una tinción diferencial que permite distinguir un grupo especial de bacterias cuya pared presenta resistencia a la decoloración por una mezcla de ácido-alcohol (BAAR).

Tiene gran importancia, porque entre las BAAR se encuentran las micobacterias, agentes etiológicos de enfermedades comola tuberculosis y la lepra.
 
Materiales:

-Microscopio.
-Fucsina fenicada.
-Mechero de alcohol.

-Agua destilada.
-Azul de metileno.
-Portaobjetos.
-Algoodón.
-Hilo.
-Alcohol.

Procedimiento:

-Se parte de una extensión fijada por calor.

-Cubrir el portaobjetos con fucsina, calentarlo como en la práctica anterior ( tinción de esporas) durante 15 minutos.

-Lavar con agua destilada.

-Cubrir con azul de metileno e incubar durante 1-3 minutos a temperatura ambiente.

-Lavar con agua destilada.

-Observar al microscopio.

Resultados:

En la imagen podemos observar  que las bacterias que resisten a la decoloración son rojas y las que no se ven de color azul.

Tinción de esporas.

Objetivo:

Observar las esporas bacterianas.

Fundamento teórico:

 Las endosporas bacterianas se sitúan en el interior del cuerpo celular y por su estructura, con varias cubiertas es impermeables . Requieren tinciones con calor para favorecer la penetración de los colorantes.
La técnicas más empleada es la tinción de Wirtz-Conklin.

Materiales:

-Mechero de alcohol
-Verde de malaquita al 5%.
-Agua destilada.
-Safranina.
-Microscopio.
-Algodón.
-Hilo.
-Alcohol.





Procedimiento:

-Partimos de una extensión fijada.

-Ponemos un papel de filtro encima del portaobjetos y lo cubrimos con verde de malaquita al 5% calentar el portaobjetos por debajo ( lo calentamos con un hilo al que ponemos una bola de algodón al que añadimos alcohol).

-Durante 5 minutos.

-Lavar con abundante agua.

-Cubrir con safranina al 0.5%.

-Lavar con abundante agua y dejar secar la preparación.

-Visualizar la preparación  al microscopio.


Resultados:

Tinción de Hiss.

Objetivo:

Observar cápsulas.

Fundamento teórico:

La tinción de Hiss es una tinción estructural diseñada para teñir esctructuras concretas, que están presentes solo en algunas especies bacterianas y que por tanto sirve como criterio de identificación.

Materiales:

-Cristal violeta al 1%.
-Sulfato de cobre al 2%.
-Microscopio.
-Asa.
-Portaobjetos.


Procedimiento:

-Partimos de una extensión sacada a temperatura ambiente.
-Teñir la extensión con con cristal violeta al 1%.
-Teñir con sulfato de cobre al 2%.
-Observar en el microscopio.


Resultados:

Las bacterias tienen un color violáceo como podemos ver en la imagen, lo que no se ve son las capsulas (azul).

En la imagen podemos ver que se ha cristalizado la tinción..

Tinción con nigrosina

Objetivo:

Observar las bacterias con cápsula, esporas, bacterias dificiles de teñir por otros métodos, como algunos espirilos.


Fundamento teórico:

La nigrosina es un colorante aniónico negro incapaz de penetrar en las bacterias, porque es repelido por la pared bacteriana. En consecuencia la tinción con nigrosina es una tinción simple negativa, se tiñe el fondo y no las bacterias.

Materiales:

-Portaobjetos.
-Nigrosina.
-Asa de siembra.
-Mechero de alcohol.
-Bacillus.

Procedimiento:

-Colocar una gota de nigrosina en un extermo de un portaobjetos.
-Cargar el asa de siembra con la muestra.
-Realizar la extensión, colocando un segundo portaobjetos limpio sobre la gota de nigrosina con la muestra y deslizándolo a lo largo del primer portaobjetos en un ángulo aproximado de 45º.
-Dejar secar a temperatura ambiente.
-Observar al microscopio.

Resultados:

En la imagen podemos observar que se ha contaminado la tinción ya que se ve bacilococos, tambien podemos ver las bacterias de color claro.

Tinción de gram.

Objetivos:

Saber realizar una tinción de gram.

Fundamentos teóricos:

La tinción de gram es una técnica diferencial, que permite identificar distintos tipos de bacterias según el color que tome su superficie , por lo que podemos clasificarlas y estudiarlas.
La prueba es muy útil para identificar rápidamente una infección y utilizar el antibiótico adecuado.

Materiales:

-Mechero de alcohol.
-Enterococos (gram positivo).
-Enterobacter (gram negativo).
-Asa de platino.
-Cristal violeta.
-Lugol.
-Alcohol-acetona.
-Safranina.

Procedimiento:

1-Partimos de una extensión fijada por calor.

2-Cubrimos la extensión con  cristal violeta durante 1 minuto a temperatura ambiente.
 

3-Lavar con agua destilada y escurrir.

4-Cubrir con lugol e incubar 1 minuto a temperatura ambiente.

5-Lavar con agua destilada y dejar escurrir el portaobjetos.

6- Cubrir con alcohol-acetona en proporción 1:1 durante 30 segundos.

 
7- Lavar con agua destilada y dejar escurrir.

8-Cubrir con safranina e incubar durante dos minutos a temperatura ambiente.
 
9-Lavar con abundante agua destilada y dejar secar a temperatura ambiente.

10- Visualizar al microscopio óptico.



Resultados:

Las bacterias Gram + se ven azules o violáceas.
Las bacterias Gram - se ven rojas.


Observaciones:

Las bacterias que observamos en la imagen son Gram +,podemos concluir que no ha aparecido    gram - porque son cultivos viejos que han perdido la capacidad de coger la tinción.

Siembra-aislamiento.

Objetivo:

Realizar una siembra  en un medio de cultivo para obtener colonias aisladas.

Fundamento teórico:

El aislamiento es la separación de un determinado microorganismo del resto de los microorganismos que lo acompañan. Gracias al aislamiento se puede realizar la identificación, asi como resiembras o estudios de sensibilidad a antibióticos. Se realiza  siembras de agotamiento para obtener colonias aisladas.

Materiales:

-Asa de siembra.
-Placa de petri con agar nutritivo.
-Bacillus.

Procedimiento:

1-Se esteriliza el asa, se coge inóculo y sobre el medio de cultivo en un punto periférico de la placa y se desplaza suavemente por su superficie con un movimiento continuo y rápido en forma de z, yendo de pared en pared  avanzando hacia el centro de la placa, hasta cubrir aproximadamente un tercio de su superficie.

2-Se gira la placa 90º en sentido contrario a las agujas del reloj y se repite el mismo movimiento con el asa de siembra.

3-Se gira nuevamente la placa 90º en sentido contrario a las agujas del reloj y se repite el mismo movimiento con el asa de siembra.

4-Se gira por última vez la placa 90º en sentido contario a las agujas del reloj. El último movimiento consiste en realizar un desplazamiento del asa en zigzag por este pasillo central, desde la periferia hacia el centro ( el resto de las lineas no toca nunca las zonas previamente sembradas) . En este pasillo crecen las colonias aisladas.

Resultados:

Preparación de medios de cultivo.

Objetivo:

Preparación  de medios de cultivo.

Fundamento teórico:

Los medios  de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento
de los microorganismos. La composición precisa dependerá de la especie que se quiera
cultivar, porque las necesidades nutricionales varían considerablemente.
Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio
normales y microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como
vitaminas, suero o sangre para crecer.

Materiales:

-Medio de cultivo deshidratado (agar nutritivo)..
-Balanza.
-Reloj de vidrio.
-Placa calecfatora.
-Imán.
-Probeta.
-Vaso precipitado.
- Placas petri.


Cálculos:

15g/l *0.5l=7.5g de agar nutritivo.

Procedimiento:

-Pesar 7.5 g de agar nutritivo en la balanza.
-Mezclar en un matraz erlemeyer  el agar nutritivo y agua destilada .
-Calentar el matraz durante unos minutos (hasta que empieze hervir ).
-Envolver el matraz con papel de aluminio y autoclavar seguir las instrucciones del fabricante.
-Sacar de la autoclave.
 -Esterilizar la boca del matrtaz aforado.
-Distribuir en placas petris estériles.
-Dejar que el medio solidifique.

Tinción simple.

Objetivo:

Realizar tinciones simples

Fundamento teórico:

La tinción simple se basa en la afinidad del colorante por los componentes celulares. La
tinción puede ser uniforme o presentar algunos gránulos en su interior. Utiliza un solo
colorante (violeta de genciana, azul demetileno, fuscina diluida).La tinción simple se utiliza
para destacar el microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras
celulares básicas.  Se utiliza solamente para incrementar el contraste.


Material:

-Sarro.
-Levadura.
-Yogur.
-Safranina
-Portaobjetos.
-Microscopio.

 Procedimiento:

1-Esterilizar el asa.
2-Coger el asa y sobre el portaobjetos extender una capa fina de sarro.
3- Fijar con calor.
4-Teñir con safranina.
5-Lavar
6-Secar la preparación.


Resultados:

Se ven células epiteliales y cocos.

Observaciones:

No me dió tiempo a observar  tinción de levadura.

Esterilización de asa y tubo.

Fundamento teórico:

El asa de siembra y el tubo de ensayo deben ser esterilizados  antes de su uso para evitar la contaminación con los microorganismos presentes en el medio ambiente.

El mechero de alcohol no solo permite crear una zona aséptica de trabajo, también nos permite esterilizar materiales.


Materiales:

-Mechero de alcohol.
-Asa de platino.
-Tubo de ensayo.
-Tapón del tubo de ensayo.

Procedimiento:

-Tomar el asa de siembra entre los dedos pulgar, indice y medio de una mano dejando libre el anular y meñique y expornela en la llama, hasta que se ponga roja.

-Tomar el tubo con la mano izquierda, destapar el tubo cogiendo el tapón con los dedos meñique y anular de la mano derecha.

-Flamear la boca del tubo.

-Meter la asa en el tubo.

-Volver a flamear la boca del tubo, taparlo y devolverlo a la gradilla.

-Sembrar en otro medio de cultivo o en un portaobjetos.

-Flamear el asa.